La Porfiria

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La Porfiria

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¿Qué son las enzimas?

Ultracentrifugación y tamizaje molecular

ULTRACENTRIFUGACION

Para poder llevar a cabo muchas de las actividades que incluye el proceso de purificación de una proteína debé previamente realizarse una homogeneización y centrifugación diferencial del tejido a partir del cual se purificará dicha proteína. Por lo tanto, en esta clase aprenderán a utilizar una ultracentrífuga y realizarán también una separación cromatográfica por tamizaje molecular.

Fig. 1. Utracentrifuga

Realizamos un homogenato de hígado de ratón en un buffer isotónico, el cual centrifugamos en una ultracentrífuga a 100.000 x g durante 60 minutos. De esta manera en el sobrenadante quedó la enzima citosólica y en el precipitado el retículo endoplasmático rugoso y liso.

CROMATOGRAFIA DE TAMIZ MOLECULAR

Consideraciones generales

El medio soporte en esta cromatografía es un dextrano entrecruzado con epiclorhidrina que permite la separación de moléculas por su tamaño. Así cuando se hace pasar una solución de de proteínas a través de una columna de este material, las partículas pequeñas entrarán dentro de las del gel y recorrerán mayor distancia que las moléculas grandes, que al no poder penetrar en la red, sólo recorren el espacio entre partículas.

Fig. 2. Esquema del tamiz

El resultado es que las moléculas grandes eluyen directamente y las pequeñas salen retrasadas. Así, el orden de elución estará relacionado con el tamaño de las moléculas.

Objetivos de la actividad propuesta (los docentes)

1)Determinar párametros cromatográficos de una columna de Sephadex G-25 mediante la siembra y elución de una mezcla de blue-dextrano y cloruro de cobalto.

2) Desalado de muestras proteicas antes de su siembra en electroforesis.

Esto es indispensable si se desea realizar con posterioridad una electroforesis, ya que la presencia de sales distorsiona las bandas.

ReactivosBlue-dextran (Azul dextrano)

Solución de CoCl2

Solución de BaCl2Reactivo de BradfordBuffer fosfato de sodio 50 mM.

Parte experimental

1) Determinación de Vo y Vt de la columna a utilizar.La metodología a seguir será la siguiente:

- Abrir la llave de la columna y dejar fluir el líquido con el cual se equilibra la columna. El relleno de la columna nunca debe dejarse secar.

-Cerrar la llave cuando queda aproximadamente 1mL.- Sembrar la solución coloreada (0,1mL). Abrir la llave dejando entrar la muestra al mismo tiempo que se comienza a recolectar fracciones del eluido (0,5mL).

- Se procede así hasta que el volumen del líquido que ha atravesado la columna sea una vez el volumen total de la misma.

En ese momento se cierra la llave, terminando la recolección de fracciones. El tiempo de goteo debe ser entre 12 y 15 segundos.

- Se determina cualitativamente Vo: volumen en que se observa el pico de coloración del Blue dextrano.

Se determina Vt: volumen en que se observa el pico de coloración del cloruro de cobalto. Se deberá graficar el perfil de elución obtenido por asignación de unidades arbitrarias a la intensidad de color de cada uno en función del volumen eluído.

- realizaremos (los alumnos) el grafico y sacaremos conclusiones para la próxima semana, para ello consultaremos bibliografía disponible.

Bienvenida!!

En este blog docentes y alumnos dejaremos testimonio de nuestra experiencias acerca de compartir un proyecto de investigación correspondiente al tema "Porfiria y Síndrome Metabólico" y aprender de qué tratan estos desórdenes metabólicos.
Por otra los docentes les enseñaremos diferentes técnicas que se usan en los laboratorios de Ciencias Experimentales, cuyas mostraciones dejaremos en este blog y los alumnos informaremos resultados de experimentos aquí mismo. Nos reunimos todos los jueves al iniciar el curso 2009. Todos seremos responsables de la construcción de este sitio virtual.